2024年4月4日，黄志伟课题组在《细胞研究》（Cell Research）上发表题为《RAGATH-18衍生RNA引导的DNA核酸内切酶的发现和结构机制》（Discovery and structural mechanism of DNA endonucleases guided by RAGATH-18-derivedRNAs）的研究文章。该研究为基因编辑提供了新的酶工程模板，有助于克服现有基因编辑技术在递送难、非目标效应和编辑效率低下等方面的困难。
细菌可进化出多种防御系统来抵御噬菌体感染。限制性修饰（RM）系统可识别并在特定位点切割入侵的DNA序列。CRISPR-Cas系统则通过将入侵者衍生出的DNA短片段整合到CRISPR阵列中来提供适应性免疫。插入序列（Insertion sequences，ISs）是最普遍的移动元件之一，也被细菌用来抵御外源感染。这些IS元件被分为不同的家族，在这些家族中，IS200/IS605和IS607转座系统是两个重要的成员。IS200/IS605转座系统编码的TnpB由一类reRNA引导去切割基因组DNA，是一种可重新编程的RNA引导的核酸酶。IS200/IS605和IS607名称虽然相近，但二者发生转座的机制并不相同，并且IS607 TnpB具体功能尚不清晰。
在该研究中，课题组首先运用生物信息学方法分析了所有可获得的细菌和古细菌基因组以及来源于各种环境的宏基因组数据，在防御岛上发现了一类保守的RAGATH-18衍生RNA（reRNA）与IS607 TnpB共同出现。课题组通过一系列生化实验证明了IS607 TnpB可与RAGATH-18衍生RNA（reRNA）相互作用，形成由RNA引导的核酸内切酶。课题组从9172株细菌中发现的10258个IS607TnpB系统中，鉴定出23种具有质粒切割活性的IS607TnpB，同时发现9株IS607 TnpB在人体细胞中显示出DNA干扰活性。这些IS607 TnpB有着与IS605 TnpB完全不同的TAM识别序列（AGGAG或GAGGG）。IS605TnpB的reRNA序列存在于TnpB的编码序列中，而IS607 TnpB的reRNA则完全独立。其中，来自于厚壁菌门细菌（ Firmicutes bacterium）IS607 TnpB （ISFba1TnpB）在细胞内表现出较强的DNA剪切活性，并展示出高保真性的特征。
课题组进一步通过冷冻电镜（cryo-EM）解析ISFba1 TnpB-reRNA-DNA的复合物结构。该结构揭示了ISFba1TnpB蛋白（387 aa）可被reRNA识别的机制，以及ISFba1 TnpB对向导RNA和DNA底物之间的错配更敏感的原因，为进一步开发ISFba1 TnpB用于基因编辑用途提供了结构基础。
目前，CRISPR-Cas系统等基因编辑工具的优化策略包括蛋白质和向导RNA工程。课题组发现的IS607 TnpB系统具有体积小、对引导和靶向DNA碱基错配的敏感性高的特点，为提高其精度、特异性和通用性提供了可能。通过蛋白工程优化IS607TnpB的TAM序列，扩大其使用范围，同样也是未来值得探索的方向。IS607 TnpB具有RNA引导核酸酶活性的发现，扩充了IS系统潜在的核酸内切酶功能，为基因编辑工具开发提供了新的酶工程模板。
黄志伟教授、张帆研究员为论文通讯作者。黄志伟课题组博士生任宽、周凤侠博士、张帆研究员、博士生尹明雨、朱玉威副研究员、硕士生王首羽为论文并列第一作者。该课题组陈彦博士、博士生黄滕锦，西湖大学博士生吴紫璇、博士生何家乐以及生命科学中心公共平台高级工程师郭长友、工程师张安琪等参与研究部分工作。
该研究获国家重点研发计划、国家自然科学基金、腾讯新基石科学基金、黑龙江省头雁团队原创探索基金资助。
论文链接：https://doi.org/10.1038/s41422-024-00952-1
在基因组和宏基因组数据中鉴定RAGATH-18 RNA相关蛋白示意图
IS607 TnpB在人类293F细胞中实现基因编辑
ISFba1 TnpB-reRNA-dsDNA冷冻电镜结构
